简单呐,主要是设计引物,分为外套引物和内套引物你可以设计单边巢式或者双边巢式的引物,如果内套引物为1和2的话,外套可以设计3和4,或者设计3和1配,或者设计3和2配.
打个比方,比如你要扩增的目的基因在第200bp～400bp,内套的引物分别在200bp处（引物1）和400bp（引物2）处.
外套引物可以设计在100bp处（引物3）和600bp（引物4）处（位置看情况自己选,要在200bp前面和400bp后面）.
或者外套引物也可以设计成100bp处（引物3）,然后和400bp处（引物2）的引物配对作为外套引物（引物3,引物2）
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